Получение меченых белков и пептидов
В тонком органическом синтезе ферменты применяют и для получения меченых соединений. В химии, биохимии, биологии и медицине для исследования механизмов реакций, контроля метаболических путей и мест локализации тех или иных соединений в организме и для многих других целей широко применяют вещества, молекулы которых содержат радиоактивные изотопы. Ферментативные реакции, используемые для получения этих веществ, имеют ряд преимуществ по сравнению с традиционными химическими методами.
Во-первых, метка должна занимать определенное положение в структуре молекул. Высокая специфичность ферментов позволяет вводить метку более направленно, чем при химическом синтезе. Во-вторых, высокая скорость ферментативных реакций дает возможность получать соединения с относительно короткоживущими изотопами, например С или 13N (периоды полураспада 20 и 10 минут соответственно). Наконец, практически полное отсутствие побочных реакций при ферментативном синтезе обеспечивает получение высокочистых продуктов, что очень важно для их использования в экспериментах с живыми организмами.
Получение меченых белков и пептидов основано на замещении атомов водорода атомами дейтерия или трития, введении изотопов 125J в боковые остатки таких аминокислот, как гистидин или тирозин, либо фосфорилировании определенных групп остатком фосфорной кислоты, содержащей 32Р. Очень удобный и высокоэффективный метод иодирования – воздействие на белки смеси KJ и Н202 в присутствии иммобилизованной пероксидазы. Йод вводится исключительно в остатки тирозина, в то время как при действии химических йодирующих реагентов, например JC1 или хлорамина Т, затрагивают другие остатки. Хорошие результаты дает «полуферментативный» метод, основанный на промежуточном дегидрировании некоторых аминокислотных остатков под действием оксидаз. Так, в присутствии индо-лил-3-алкан а-гидроксилазы остатки триптофана модифицируются следующим образом (R-индол):
Образовавшаяся двойная связь легко присоединяет такие молекулы, как 125JC1 или 125J2, а также подвергается каталитическому гидрированию изотопами водорода, JXs или Тг.