Стабилизация ферментов
Разработанными приемами можно достичь стабилизации ферментов в сотни, тысячи и даже миллионы раз. Удалось увеличить время жизни фермента при 60- 70° С от нескольких минут до месяцев, что уже вполне приемлемо для целей технологии.
Весьма оригинальный путь к получению термостабильных ферментов подсказывает сама природа. Существуют так называемые термофильные микроорганизмы, живущие при температурах 60-70° С и даже выдерживающие до 110° С в горячих источниках Камчатки. Очевидно, что ферменты этих микробов обладают повышенной термостабильностью. В настоящее время ведется довольно интенсивный поиск и культивирование таких микроорганизмов, а также выделение из них ферментов. Иммобилизация на твердых носителях резко препятствует межмолекулярным процессам инактивации, в частности агрегации и автолизу, т. е. расщеплению гидролитического фермента под его собственным воздействием.
В последнее время разработан метод реактивации денатурированных ферментов, препятствующей инактивации. Суть его в следующем. Денатурированный белок, как правило, находится в промежуточном состоянии между полностью – статистическим клубком и глобулой, ибо часть внутримолекулярных связей, например дисульфидных связей – S-S-, при тепловой инактивации сохраняется. Оказалось, что если такую молекулу фермента полностью развернуть (это достигается действием сильных, но обратных денатурантов, таких, как мочевина или гуанидин, в сочетании с восстановителями типа дитиотреитола, восстанавливающими связи – S-S – до – SH), а затем дать ей возможность медленно свернуться (убрав денатуранты и заменив восстановитель на окислитель, обычно кислород воздуха), то образуется вновь активная молекула, т. е. восстанавливается исходная конформация глобулы.
Иммобилизуют не только выделенные ферменты, но и целые клетки микроорганизмов Чаще всего их включают в полиакриламидный гель либо в гель каррагинана – полисахарида из морских водорослей. Использование клеток по сравнению с выделенными ферментами имеет ряд преимуществ. Процесс обходится значительно дешевле, а, кроме того, ферменты в клетках часто стабильнее, чем в выделенном состоянии. К недостаткам применения клеток относится часто очень низкая проницаемость клеточных оболочек для субстратов.