Методы, основанные на пришивке НАД и АТФ через аминогруппу
При ковалентной иммобилизации ферментов кофакторы должны быть «пришиты» к носителю. Однако здесь возникают большие трудности – ковалентная иммобилизация кофакторов часто приводит к полной потере ими реакционной способности. Это объясняется тем, что носитель создает сильные пространственные затруднения для контакта кофактора с активным центром фермента. Для устранения этого эффекта связывание кофермента проводят таким образом, чтобы он оказался несколько отодвинутым от поверхности носителя. Для этого ковалентную иммобилизацию проводят с помощью реагента, содержащего достаточно длинную углеводородную цепочку, концы которой связываются с носителем и боковой группой кофермента.
Так, хорошие результаты дают методы, основанные на пришивке НАД и АТФ через аминогруппу аденино; вой части кофакторов с помощью таких процессов (R-адениновый фрагмент молекулы):
В обоих случаях создается «ножка», содержащая на конце аминогруппу, через которую можно связать кофермент с носителем, сохранив достаточно высокую реакционную способность кофактора. Другой удовлетворительный способ иммобилизации коферментов состоит в связывании их с растворимым полимерным носителем. Растворимый полимер в меньшей степени ограничивает подвижность кофермента и, как правило, такая модификация не приводит к потере его реакционной способности. Для удержания кофермента в проточном реакторе здесь можно воспользоваться полупроницаемой мембраной.
В последние годы развивается еще один интересный метод, состоящий в ковалентной пришивке кофактора прямо к ферменту вблизи его активного центра. Для этого используют те же химические процессы, что и для связывания кофакторов с носителями.