Маллигэн и Индер Верма, молекулярный биолог, также работающий над проблемой АДА, рассуждали так: поскольку ретровирусы естественным путем внедряют свои гены в клетки, можно попытаться заставить их проделать то же самое с чужимы генами. С этой целью они «сшили» человеческий и вирусный гены и заразили ими клетки в культуре. Задачей ученых было создать новый вид ретровирусов, которые могли бы переносить ген в клетки человека, но при этом были бы прочно заперты в них.

Группа Маллигэна взялась за эту непростую задачу. Каждый из них по отдельности уже неспособен порождать новые вирусы. Для этого из’ одного вируса они удалили гены, ответственные за создание белковой оболочки, необходимой ему, чтобы проникнуть в клетки, и заменили их нужным чужим геном. Из другого, так называемого вируса-помощника, они удалили последовательность генов, которая дает «сигнал» белковой оболочке обернуться вокруг вирусной РНК и образовать новый вирус. Когда оба таких «вируса калеки» вводятся в клетки культуры, вирус-помощник обеспечивает всю необходимую работу по «упаковке» и внедрению в клетку комбинированного вируса, однако сам внедриться в клетку не может. Вектор – нечто подобное мулу в мире вирусов: он может внедриться в клетку, но, будучи внутри, не может воспроизводиться, поскольку в его РНК отсутствуют необходимые инструкции для этого. Он оказывается навсегда заключенным в клеточной ДНК.

Маллигэн удовлетворен проделанной работой. Он утверждает, что в своей основе такая вирусная система транспортировки генов совершенна. Действительно ее с успехом уже использовали для переноса генов человека в клетки человека, выращенные в культуре. Однако они собираются поставить дополнительные эксперименты, чтобы проверить полную безопасность таких вирусов-векторов. Они также пытаются сделать их еще более совершенными курьерами.

Существует несколько генетических заболеваний – такие, как болезнь Альцгеймера и некоторые виды рака, – которые могут воз – • Айкать, если не один, а несколько генов «собьются с пути». Не вызывает сомнения, что такие болезни будут неподвластны генной терапии еще многие годы. Первые попытки будут нацелены на некоторых из 1600 генетических заболеваний, вызванных нарушением Только в одном из около 100 000 генов, упакованных в каждой из наших клеток. Среди этих болезней – цистный фибриоз, мышечная дистрофия, гемофилия, болезнь Хантингтона, а также уже упоминавшиеся АДА и синдром Леш-Нихена. Дефектные гены, вызывающие последние две болезни, уже «идентифицированы, и их нормальные копии могут быть клонированы лабораторным путем.

Ричард Маллигэн из Института биомедицинских исследований им. Уайтхеда, входящего в Массачусеттский технологический институт (МТИ) вместе с Стюартом Оркином, профессором педиатрип Гарвардской медицинской школы, а также с Игорем Лемишкой и Дэвидом Уильямсом из МТИ занялись АДА. Эта болезнь первый кандидат для генной терапии, поскольку она возникает из-за дефицита фермента в костном мозге, ткани, которая сейчас обеспечивает наилучший маршрут для внедрения здоровых генов в организм. В костном мозге образуются лимфоциты – основной элемент иммунной системы организма. Дефицит фермента приводит к выработке токсинов, которые и препятствуют нормальному развитию Т-лимфоцитов.

Ферменты имеют четкую связь с генами, в каждом из которых закодирован синтез отдельного белка. Если ген дефектен, то либо будет образовываться ненужный белок, либо он вообще не сможет передать команду на производство белка. Если недостающий белок важен для организма, то без него он не сможет нормально функционировать, Цель генной терапии – трансплантировать ген, который будет производить недостающий белок.

]]> http://wantys.ru/?feed=rss2&p=19 0 http://wantys.ru/?p=50 http://wantys.ru/?p=50#comments Wed, 03 Mar 2010 13:08:47 +0000 admin http://wantys.ru/?p=50 Спрашивается, можно ли использовать эти свойства ферментов для практических целей? Можно, но этому мешали, а частично мешают и до сих пор два обстоятельства. Во-первых, ферменты, как правило, гомогенные катализаторы, что весьма неудобно с технологической точки зрения, так как такой катализатор трудно отделять от продуктов реакции и использовать повторно. Во-вторых, ферменты довольно нестабильны и обычно не могут функционировать достаточно длительный срок.

На протяжении последних 15-20 лет все эти проблемы были решены, ферменты стали полноправными компонентами технологических схем, и возникла перспективная отрасль знания – инженерная энзимология, важная составная часть современной биотехнологии.

Первая проблема была решена путем развития методов иммобилизации ферментов. Под иммобилизацией понимают такую процедуру, в результате которой молекула фермента тем или иным способом прикрепляется к объектам, не растворимым в. воде. Эти объекты вместе с ферментом легко отделяются от раствора после завершения реакции.

Была решена и проблема стабилизации ферментов. Для этого потребовалось развитие таких методов иммобилизации, которые одновременно приводили к повышению прочности белковой глобулы. Более подробно на этом мы остановимся ниже.

Другой путь применения ферментов в этой области – ферментативный синтез (З-лактамных антибиотиков. Гидролиз амидной связи – реакция обратимая:

Буквой Q здесь обозначено ядро антибиотика, образованное р-лактамным и серосодержащим кольцами. Пенициллинамидаза, как и любой химический катализатор, не смещает равновесия, а только увеличивает скорость его достижения. Значит, фермент катализирует как прямую реакцию – гидролиз, так и обратную – синтез антибиотика. Это обстоятельство используют для ферментативного синтеза.

Водный раствор, содержащий 6-АПК или 7-АДЦК, а также соответствующую кислоту, приводят в контакт с иммобилизированной пенициллинамидазой. Через некоторое время в растворе образуется равновесное количество антибиотика. Преимущество метода перед химическим ацилированием в его простоте; например, можно использовать прямо кислоту, а не ее хлорангидрид. Основной недостаток – крайне низкая скорость реакции для большинства R. Причина этого, как ни странно, кроется в качестве, считавшемся до сих пор большим преимуществом фермента, – в его высокой специфичности. Выделяемая в настоящее время пенициллинамидаза из Б, coli с высокой скоростью превращает субстраты, содержащие в боковой цепи, только бензильную группу, а gри наличии в боковой цепи также аминогруппы (ампициллин) скорость падает в 103-104 раз. Выход ищут в использовании ферментов из других источников, обладающих иной специфичностью.

Шесть лет назад первая попытка генной терапии закончилась неудачно. Мартин Клайн попытался химическим путем трансплантировать созданные в лаборатории гены в клетки костного мозга двум женщинам •- больным анемией Кули (болезнь крови). Пациентки не излечились, хотя побочных эффектов от лечения не было. Однако Клайн подвергся критике научных кругов за Проведение, как впоследствии было доказано, преждевременного эксперимента.

Сейчас в США несколько групп занимаются проблемой генной терапии. Все они, как правило, состоят из представителей ученых разных специальностей: клиницистов, молекулярных биологов и оио-химиков, часто представляющих различные институты, поскольку ни одна отдельная лаборатория не имеет достаточного опыта, чтобы; разработать целиком подход к лечению генетических заболевании. Их приверженность сложному делу исходит из четкого осознания, того, что современная медицина позволяет лечить лишь небольшое число из более чем 3 000 известных генетических заболевании,

В настоящее время ферменты даже микробного происхождения значительно дороже серебра, но применять их можно в очень малых количествах, так что стоимость ферментных фотоматериалов оказывается не выше серебряных.

Теоретически возможная (пока, правда, не достигнутая на практике) чувствительность фотоэнзографиче-ских материалов выше, чем серебряных. Кроме того, они обладают и более высокой разрешающей способностью, так как в них нет зерен, которые формируют изображение в обычной фотографии. Есть, конечно, у фотоэнзографии и свои трудности. Наибольшая из них – получение фоточувствительных предшественников ферментов, реактивируемых видимым светом. Рассмотренная выше система на основе производных коричной кислоты работает только в ультрафиолетовой области спектра, и это накладывает большие ограничения на ее практическое использование.

Наконец, отметим еще два процесса, основанных на ферментативных превращениях легкодоступных химически циклических соединениях. Одно из них, а-аминокапролактам, подвергаясь гидролизу под действием а-аминокапролактамгидролазы, дает L-лизин и D-, а-аминокапролактам. Последний рацемизуют либо химически, либо ферментативно и вновь подвергают энантиоселективному гидролизу.

Второй процесс основан на гидролизе 5 замещенных гидантоинов.

Гидантоины получают конденсацией альдегидов с KCN и (NH4)2C03. Для них характерна очень легкая рацемизация. Фермент гидантоиназа гидролизует только D-изомер (один из редких способов получения L-аминокис-лот), в нашем случае до D-, а-аминофенилуксусной кислоты, необходимой для синтеза некоторых антибиотиков, а оставшийся L-изомер быстро рацемизуется и, таким образом, в конечном счете. получается Z-аминокислота с высоким выходом.

Мы рассмотрели важнейшие пути ферментативного получения аминокислот. Теперь кратко остановимся на синтезе оксикислот, где возникают сходные проблемы.

Наиболее успешным энзимологический подход оказался для синтеза L-яблочной кислоты, которая широко применяется как заменитель лимонной кислоты в пищевой промышленности. Химически может быть получена только рацемическая D, L-яблочная кислота. В то же время чистую L-яблочную кислоту можно получать по реакции гидратации фумаровой кислоты в присутствии фумаразы – процесса, аналогичного синтезу аспарагиновой кислоты. В качестве катализатора используют клетки микроорганизмов, иммобилизованные в геле каррагинана.

Болезнь, которую попробуют вылечить таким способом, вероятно, будет одной из двух редких наследственных заболеваний – дефицит аденозиндезаминазы (АДА) или синдром Леш-Нихена, За этими названиями скрываются суровые недуги: АДА так угнетает иммунную систему человека, что обычная простуда может стать для него причиной смерти.

Американский мальчик Дэвид, проведший большую часть своей 12-летней жизни в герметичном пластиковом скафандре, страдал именно этим заболеванием. Дети мужского пола, жертвы синдрома Леш-Нихена (редкой формы мозгового паралича) часто страдают почками, подагрой, артритами, замедленным умственным развитием, у них неконтролируемые позывы калечить самих себя.

Итак, разработка лечения по новой методике, называемой генной терапией, продолжается. Созданные человеком вирусы заразят клетки костного мозга в пробирке, транспортируя «полезные» гены в их наследственный аппарат. Когда эти клетки вновь введут пациенту, у которого они были взяты, правильно функционирующие гены возьмут на себя работу дефектных, не выполняющих свои обязанности. Если это произойдет, то вероятнее всего пациент выздоровеет, и наука проложит курс к лечению сотен других наследственных заболеваний. Человек получит инструмент для совершения того, о чем совсем недавно нельзя было и мечтать – перекраивать по собственной воле свои гены. Однако эта форма генной терапии сможет изменить набор генов только самого лечащегося пациента. Новые гены не передаются зародышевым клеткам, из которых образуются яйцеклетки и сперматозоиды, и, следовательно, не смогут передаваться по наследству потомству.

Ген гормона роста овец ввели в эмбрион, когда он состоял из одной клетки. Затем эту клетку имплантировали другой овце, которая и выносила ягненка. Ягненок с геном гормона роста появился на свет в апреле этого года. Должно пройти еще шесть недель, прежде чем ученые наверняка узнают, будет ли дополнительный ген производить гормон, однако Тревор Скотт, руководитель отделения Животноводства крупнейшей австралийской исследовательской организации ЦСИРО, надеется на успех. Лабораторные исследования показали, по словам Скотта, что новые гены внедрились в клетки «трансгенной» овцы. Примерно через пять недель ей введут небольшую дозу цинка (который «включит» ген, активируя регуляторную последовательность оснований ДНК), чтобы началось дополнительное производство гормона роста.

Если эксперимент окажется удачным, такой метод позволит выращивать животных в полтора раза крупнее и растущих в 1,3 раза быстрее, чем обычно. Сейчас ученые работают над проблемой введения новых генов, ответственных за выработку двух ферментов, которые позволят, организму овцы вырабатывать метионин – аминокислоту, необходимую для роста волокон шерсти и которая может попасть в организм животного только вместе с пищей.

Скотт рассматривает генный трансплантант – результат более чем трехлетней работы – как фундаментальный научный шаг вперед, который приведет к принципиально новому подходу в деле разведения и выращивания сельскохозяйственных животных. Это первый случай в мировой практике успешной трансплантации гена гормона роста. Другим научным группам во всем мире до сих пор удавалось получить лишь «трансгенных» мышей, а американским исследователям – ввести ген человеческого гормона роста в генетический аппарат свиньи.

Развитие биоэлектрокатализа приведет к разработке. эффективных энергетических систем. Пока почти не исследованы перспективы развития биоэлектрокаталитического синтеза, но и здесь следует ожидать успешного применения ферментов.

Несомненно, что инженерная энзимология как часть биотехнологии вступила сейчас в этап интенсивного раз-. вития. В Основных направлениях экономического и социального развития СССР на 1986-1990 годы и на период до 2000 года говорится: «Разрабатывать научные основы… биотехнологии. Развивать физико-химическую биологию, научные основы получения физиологически активных веществ для медицины и сельскохозяйственного производства; разрабатывать проблемы иммунологии.., методы и средства профилактики, диагностики и лечения наиболее распространенных заболеваний». В решении этих задач немалая роль отводится и инженерной энзимологии.