В реакциях получения тирозина можно использовать не только фенолы, но и другие гетероциклы. Например, при введении индола в присутствии триптофаназы получается триптофан:

Наконец, отметим еще два процесса, основанных на ферментативных превращениях легкодоступных химически циклических соединениях. Одно из них, а-аминокапролактам, подвергаясь гидролизу под действием а-аминокапролактамгидролазы, дает L-лизин и D-, а-аминокапролактам. Последний рацемизуют либо химически, либо ферментативно и вновь подвергают энантиоселективному гидролизу.

(далее…)

Два рассмотренных нами процесса уже реализованы на практике. Несколько перспективных процессов находятся в стадии полупромышленной или лабораторной разработки.

Тирозин можно получить в результате обратимой реакции конденсации фенола, аммиака и пировиноградной кислоты:

В качестве катализатора используют иммобилизованные клетки, содержащие тирозинфеноллиазу. В связи с обратимостью реакции невозможно достичь выхода продукта выше 70-90%. Процесс ведут таким образом, что продукт, L-тирозин, обладающий низкой растворимостью, отделяют фильтрованием, а непрореагировавшие исходные вещества возвращают в цикл.

(далее…)

Промышленный процесс выглядит следующим образом. Исходными веществами служат модифицированные по аминогруппе D, L-аминокислоты (так принято обозначать рацемическую смесь), полученные в процессе химического синтеза. На эту смесь воздействуют иммобилизованной аминоацилазой. Фермент гидролизует амидную связь только у L-изомера. В результате образуется свободная L-аминокислота, обладающая более высокой растворимостью, чем ацильное производное. Образовавшуюся смесь свободной L-аминокислоты и ацилированной D-аминокислоты разделяют простыми физическими методами, пользуясь их различной растворимостью. Оставшийся после разделения D-изомер обычно при повышенной температуре рацемизируют, т. е. превращают в исходную D, L-смесь и снова пускают в реакцию с ацилазой. В итоге добиваются высокой концентрации L-аминокислоты. Фермент аминоацилаза мало чувствителен к типу аминокислоты, и поэтому одна установка с иммобилизованным ферментом может использоваться для получения самых разнообразных L-аминокислот.

Иммобилизацию аминоацилазы проводят адсорбцией на специально подобранном полимерном носителе. Когда ее активность падает, в реактор добавляют свежую порцию фермента (1 раз в несколько месяцев), которая тут же адсорбируется на носителе.

(далее…)

Аминокислоты используют в медицине, сельском хозяйстве, прикладной микробиологии и во многих отраслях науки. Они необходимы как компонент питания при недостаточности какой-либо из природных (особенно незаменимых) аминокислот, как составная часть внутривенного питания больных людей, для создания лекарственных и биохимических соединений и т. д. Все аминокислоты усваиваются только в L-форме (за исключением метионина), а попадание в организм D-формы крайне нежелательно.

Напомним, что L – и D-формы – это так называемые энантиомеры, разновидность изомеров, являющихся зеркальными отражениями друг друга. Смесь L – и D-форм в равных количествах называют рацемической4. Ей присущи все свойства чистого вещества, ибо L – и D-изомеры во всех отношениях идентичны, кроме тех случаев, когда они вступают во взаимодействие с другим асимметрическим (т. е. обладающим L – и D-формами) объектом. Таковы белки, в частности ферменты, живых организмов, так как они образованы только одной L-формой аминокислот. Именно поэтому живые организмы «узнают» энантиомеры аминокислот.

Химический синтез всех аминокислот – давно решенная и, в общем, не очень сложная задача. Однако химические методы дают всегда рацемическую смесь аминокислот, и, следовательно, необходима дополнительная стадия разделения энантиомеров. Чисто химически это сделать очень трудно. В то же время ферменты способны «узнавать», а значит, и по-разному реагировать на L – и D-формы аминокислот или их производные. Преимущественное расщепление одного из энантиомеров под действием ферментов настолько предпочтительно, что, как правило, они быстро реагируют с L-изомером, совершенно не затрагивая D-изомер. Это обстоятельство т. е. энантиоселективность, и было положено в основу ферментативного разделения рацемических смесей аминокислот.

Разработанными приемами можно достичь стабилизации ферментов в сотни, тысячи и даже миллионы раз. Удалось увеличить время жизни фермента при 60- 70° С от нескольких минут до месяцев, что уже вполне приемлемо для целей технологии.

Весьма оригинальный путь к получению термостабильных ферментов подсказывает сама природа. Существуют так называемые термофильные микроорганизмы, живущие при температурах 60-70° С и даже выдерживающие до 110° С в горячих источниках Камчатки. Очевидно, что ферменты этих микробов обладают повышенной термостабильностью. В настоящее время ведется довольно интенсивный поиск и культивирование таких микроорганизмов, а также выделение из них ферментов. Иммобилизация на твердых носителях резко препятствует межмолекулярным процессам инактивации, в частности агрегации и автолизу, т. е. расщеплению гидролитического фермента под его собственным воздействием.

(далее…)

Суть большинства из этих подходов в том, что искусственно закрепляют каталитически активную исходную конформацию фермента. Для этого обрабатывают фермент каким-либо сшивающим реагентом, например диальдегидом. Наиболее распространенный реагент – глутаровый альдегид (НОС(СН2)зСОН). В результате его взаимодействия с аминогруппами фермента появляются дополнительные связи между участками; полипептидной цепи, которые и препятствуют ее разворачиванию. Совершенно очевидно, что активная конформация фермента будет стабилизироваться и тогда, когда при иммобилизации белковая глобула будет связываться не в одной, а в нескольких точках. При этом, как и в предыдущем случае, на молекулу фермента будут как бы наложены скобки, скрепляющие его исходную конформацию. Специальные опыты показали, что увеличение стабильности (замедление инактивации) ряда ферментов действительно коррелирует с числом связей между носителем и ферментом.

Третий подход состоит в том, что фермент включают в небольшие «тесные» для него поры носителя. Тогда стенки поры препятствуют разворачиванию глобулы. Этот эффект наблюдали при изучении зависимости скорости инактивации а-химотрипсина от концентрации полиакриламидного геля, в котором он был иммобилизован. Оказалось, что при определенной концентрации ак-риламида (около 50%) происходит резкое падение скорости инактивации. В этих же условиях физическими методами зарегистрировано резкое падение подвижности ферментной глобулы.

В общем, вопрос об иммобилизации ферментов сейчас можно считать решенным. Широкий арсенал рассмотренных методов позволяет для любого фермента подобрать подходящий прием иммобилизации с сохранением достаточно высокого уровня активности.

Более сложна проблема стабилизации ферментов. Что приводит к инактивации ферментов? Во-первых, как и все белки, они могут быть «съедены» микроорганизмами, всегда присутствующими в окружающей среде. Во-вторых, может происходить межмолекулярная агрегация белковых молекул, а в случае гидролитических ферментов так. называемый автолиз, т. е. гидролиз молекул фермента под его собственным воздействием. В-третьих, молекула фермента может потерять свою трехмерную структуру (конформацию) в результате нарушения взаимодействий боковых групп полипептидной цепи под действием тепла, повышения или понижения кислотности среды, органических растворителей и т. д. Как правило, белковая глобула при этом разворачивается и переходит в клубок. Это приводит к разрушению активного центра фермента и потере активности. Наконец, в-четвертых, инактивация может происходить за счет химической модификации функциональных групп, например вследствие аутоокисления или реакций с примесями.

(далее…)

Очень распространенный метод иммобилизации – включение ферментов в волокна. Сначала получают эмульсию водного раствора фермента (либо суспензию сухого фермента) в органическом растворителе, содержащем полимер, способный образовывать волокна. Чаще всего используют триацетатцеллюлозу, а также нитроцеллюлозу, этилцеллюлозу и т. п. Затем эту эмульсию продавливают через тонкие отверстия в другой растворитель, вызывающий коагуляцию полимера. Получаются волокна, содержащие микрокапельки (порядка 1 микрона) водного раствора фермента.

Не меньшее распространение, чем физические, получили химические методы иммобилизации ферментов. Суть их заключается в образовании ковалентных связей между носителем и ферментом. Мы не будем останавливаться на деталях химической предобработки носителей и методик иммобилизации.

Процессы часто могут затрагивать сразу несколько функциональных групп фермента. Очень перспективен метод сочетания ковалентной пришивки с включением в гель. В этом случае предварительно модифицируют фермент мономером, например остатком акриловой кислоты. Для этого ацилируют аминогруппы белка хлорангидридом акриловой кислоты. Затем сополимеризуют модифицированный белок, скажем, с акриламидом и билакриламидом.

(далее…)

Пожалуй, большее распространение получил другой физический метод иммобилизации ферментов: включение их в различные полимерные гели. Суть метода состоит в том, что фермент вводят в раствор мономера и подходящего сшивающего реагента, а затем проводят полимеризацию, в результате чего образуется трехмерная сетка геля, в ячейках которой «застревают» крупные молекулы фермента. В то же время для низкомолекулярных субстратов такой гель проницаем. Поэтому активность фермента по отношению к таким субстратам сохраняется, но, разумеется, в случае высокомолекулярных субстратов метод не пригоден.

Наибольшее распространение получил метод включения ферментов в полиакриламидный гель. Фермент вводят в раствор акриламида (CH2=CHCONH2) и сшивающего реагента бисакриламида (CH2 = CHCONHCOCH = ,-=СН2), добавляют инициатор полимеризации, например (NH4)2S208, и получают гель с иммобилизованным ферментом, который обычно используют в виде гранул. Полимеризацию можно проводить и без инициатора под действием у-излучения. Такой радиационно-химический метод имеет ряд преимуществ: система не загрязняется продуктами распада инициатора и можно обойтись без сшивающего реагента, так как сшивка полимерных цепей идет прямо под действием облучения. Кроме акриламидных гелей, используют (но в меньшей степени) гели поливинилового спирта, поливинилпирролидона, полиметакриловой кислоты и ряд других.

(далее…)

Идея иммобилизации ферментов отнюдь не нова. Еще в 1916 г. английские химики Нельсон и Гриффин установили, что адсорбированная на алюмогеле инвертаза сохраняет свою активность. Однако широкие масштабы исследования по иммобилизации ферментов приняли лишь в 60-70-х годах, когда назрела потребность в разработке технологичных ферментных катализаторов.

Гетерогенные катализаторы обладают по сравнению с гомогенными рядом общеизвестных преимуществ. Они легко отделяются от реакционной среды, что позволяет их многократно использовать и получать продукты, не загрязненные ферментами. Они позволяют вести процесс непрерывно, что, как правило, значительно выгоднее, чем проведение периодического процесса. Но есть и свои особенности при иммобилизации ферментов: носитель может оказывать сильное влияние на стабильность и активность иммобилизованного фермента. При правильном использовании этого обстоятельства можно одновременно решить и проблему гетерогенизации, и проблему стабилизации фермента к действию температуры и среды. Остановимся прежде всего на методах иммобилизации ферментов.

Простейший и наиболее старый способ состоит в адсорбции фермента на твердом носителе неорганической (силикагель, окись алюминия, активированный уголь и т. п.) или органической (иониты, полисахариды и т. п.) природы. Неорганические носители обладают хорошими механическими свойствами. Особенно удобны разработанные в последнее время пористые стекла и пористая керамика. К недостаткам способа относятся значительная неспецифическая сорбция посторонних веществ и часто недостаточно прочное удерживание фермента на носителе.

(далее…)